亚细胞定位

亚细胞定位技术服务

我们的技术优势

✅ 高精度成像系统：共聚焦显微镜 + 超分辨率成像（分辨率达0.1μm），无需额外的标记或处理步骤，实验结果更加直观和易于理解。

✅ 多标记兼容性：支持4通道同步标记（如EGFP/mEmerald(超强绿色荧光)/EYFP/CFP/ RFP/mCherry/DAPI等）

✅ 高表达量的亚细胞定位启动子及配套的不同强度荧光蛋白，这使得即使目标蛋白在细胞内的表达量较低，也能够被清晰地观察到。

✅ 高侵染能力的农杆菌突变体，增加瞬时蛋白表达量

✅ 高效表达异源蛋白的烟草及拟南芥突变体；可以在活细胞中进行实时观察，避免了因处理过程对细胞造成的损伤和改变。

✅ 实验经验丰富：专注于植物细胞样本分析

实验流程

服务内容

服务说明

1. 浦芥免费为客户提供亚细胞定位预测服务，常用预测软件Cell-PLoc及TargetP - 2.0。

软件链接：  http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/

                     https://services.healthtech.dtu.dk/services/TargetP-2.0/

Reference:

Kuo-Chen Chou and Hong-Bin Shen, "Cell-PLoc: A package of web-servers for predicting subcellular localization of proteins in various organisms", Nature Protocols, 2008, 3, 153-162.

José Juan Almagro Armenteros, Marco Salvatore, Ole Winther, Olof Emanuelsson, Gunnar von Heijne, Arne Elofsson, and Henrik Nielsen. Life Science Alliance 2 (5), e201900429. doi:10.26508/lsa.201900429  (Open access)

2. 浦芥建立的丰富的亚细胞定位载体资源，包含了基于绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白的亚细胞定位载体库，方便选择使用。亚细胞定位载体选择参见 《浦芥生物亚细胞定位可用载体列表》。

浦芥生物亚细胞定位可用载体列表

3. 浦芥具有各类细胞器定位的Marker载体，包括细胞核、细胞膜、叶绿体、液泡膜、内质网、高尔基体、自噬小体、过氧化酶体、线粒体等，部分Marker还有多种荧光蛋白，以方便共定位时选择。共定位可用的细胞器Marker参见 《浦芥生物共定位可用的细胞器Marker列表》。

浦芥生物共定位可用的细胞器Marker列表

4. 为保证烟草转化效率，本公司不接受客户提供的农杆菌。客户如有特殊检测要求，双方协商具体服务事项。亚细胞定位技术服务内容包括：亚细胞定位预测、基因克隆、载体构建与验证、农杆菌转化、侵染、共聚焦显微镜观察拍照。各项目可整体检测也可单独检测。

5. 收费方式：后付费，零预收费启动项目。亚细胞定位和共定位有荧光信号就收费，没有荧光信号不收费。待项目完成数据交与客户认可后，30日内开具发票，转账付费。

6. 结果确认。客户收到本公司的结题报告后，请务必在7日内确认结果，如有问题及时反馈售后人员，到期如无异议，默认该项目成功。

7. 本合作仅限于为科研单位或个人提供亚细胞定位技术服务，所交付的产物仅作为实验室的研究材料使用，不具备商业用途，合作双方应在国家相关法律法规允许的范围内使用，违者对产生的后果自行负责，本公司不承担任何连带责任。

客户提供材料

1. 目的基因序列，名称等注释信息，如果特别要求请在备注中注明；

2. 如客户需提供质粒，质粒浓度为>100ng/μl，荧光蛋白的颜色或者激发光和发射光波长等信息；

3. 尽可能详细的填写“亚细胞定位服务登记表”，发送至售前销售的微信 15301627726 或邮箱 sales01@pujiebio.com；

反馈客户结果

1. 客户委托本公司构建载体，项目结束后提供构建好的载体及相关测序结果。

2. 激光共聚焦显微镜观察拍照。每个载体提供三组图片数据，每组数据包括荧光亚细胞定位图，DIC图和Merge图；如果是亚细胞共定位，每组数据包括荧光亚细胞定位图，细胞器Marker荧光定位图，DIC图和Merge图。

3. 提供包含详细实验步骤、分析整理图片结果的结题报告，以及亚细胞定位的原始图片。《亚细胞定位技术服务结题报告-模板》【注：此模板仅供参考】

【备注：内质网在细胞质内侧广泛分布，是一个连续的膜系统，从核膜一直延伸到细胞膜，广泛分布，结构较为分散。高尔基体分布在细胞核膜附近，是由膜囊堆叠形成的较为集中的结构，膜比较有规律，数量较少。但植物细胞由于中央大液泡的影响，会将细胞内的成分推挤到更靠近细胞膜的地方，因此有些高尔基体和内质网定位的蛋白观察到有点类似于细胞膜、细胞核的定位。如果要具体确认定位，则需要做高尔基体，内质网的共定位。】

常见问题及解析（Q&A）

Q：构建亚细胞定位载体时，目标蛋白连在荧光蛋白的N端更好，还是C端更好？

A: 大部分文献一般都是把目标蛋白连在N端，GFP放在C端；如果目标蛋白连在C端，在加工过程中有可能信号肽 会连同GFP一起被切掉 ，导致荧光淬灭，或荧光信号弱。也有少部分目标蛋白必须连在C端才有信号。极少的目标蛋白需要连入GFP中间才有信号。融合在荧光蛋白N端的目标蛋白一般无法得到过氧化物酶体的定位结果，融合在荧光蛋白C端的目标蛋白一般无法得到线粒体、质体的定位结果。选择融合位置时需考虑蛋白质的性质和功能，有时可能需要尝试两种方式以确定最佳融合位点。

Q：为什么亚细胞定位实验结果和预期不符？

A: 不同物种或品种的植物细胞在翻译表达基因时，其表达模式和影响因子不同。建议实验时尽可能选用与目的基因来源相近的受体材料进行表达。不同时间点取样拍照，定位位置不同。活体细胞状态下，某些蛋白有信号肽，会移动。部分蛋白在特定条件（如缺氧）下会发生亚细胞定位改变，需查阅文献确认正常定位。GFP等标记物融合位置（N端/C端）可能改变定位结果，需根据蛋白序列调整融合策略。有些预期不符的情况可能是由‌仪器分辨率限制的，低分辨率仪器可能无法区分相邻亚细胞结构（如内质网与细胞膜）；‌荧光波长与仪器不匹配会导致信号检测偏差，需更换标记物或调整仪器设置。建议优先排查实验操作问题，若仍无法解决则需考虑蛋白自身特性或物种差异。查阅数据库信息或者参考文献，明确靶蛋白的定位情况，设置空白对照。

Q：为什么不同的受体材料有时得到的定位结果不一样？

A: 不同物种或品种的植物细胞在翻译表达基因时，其表达模式和影响因子不同。受物种差异的影响，同一个载体在不同的受体材料中表达的位置可能不同。建议实验时尽可能选用与目的基因来源相近的受体材料进行表达。

Q：已知一个基因，其翻译的蛋白很可能是分泌蛋白，用烟草做亚细胞定位的话，后期需不需要做质壁分离处理？如果需要，应该怎么做？

A: 当目标蛋白为分泌肽或含信号肽结构，预测定位于细胞外基质时，可先做初步定位，观察其是否存在胞质弥散或细胞边缘聚集的定位情况，也可对分泌蛋白进行监测‌，分别在侵染后24h、48h、72h取样，观察荧光从内质网→高尔基体→囊泡的动态迁移‌。如有，可追加质壁分离验证；对于明确为胞内细胞器定位的蛋白则无需质壁分离。

‌质壁分离的最佳处理时间‌是在荧光蛋白充分表达后（农杆菌注射后48-72小时）进行，过早处理易因蛋白表达不足导致信号微弱。

‌【操作流程】：① ‌叶片处理‌：切取表达荧光融合蛋白的烟草叶片（约1cm²）。② 浸入 ‌0.5–0.8 M蔗糖溶液‌（高渗液）中，避光孵育10-15分钟。③‌ 显微观察‌：将叶片置于载玻片上，加盖玻片轻压，激光共聚焦显微镜下观察。‌原生质体与细胞壁分离形成空隙表明质壁分离成功。‌④ 定位判定荧光信号位于空隙处（质外体），或附着于收缩的原生质体（膜结合）。

【注意事项】：① 质壁分离会破坏细胞膜完整性并改变蛋白分布环境，而分泌蛋白的定位需在活细胞或接近生理状态下观察，以保持其动态分泌过程的真实性。实验处理不当会导致细胞破裂或死亡，荧光信号弥散。因此‌蔗糖浓度需要优化，蔗糖处理时间严格控制在10-15分钟。② 渗透胁迫可诱导蛋白错误定位（如应激蛋白向膜迁移）‌，应该进行关键对照实验设计，观察排除。③ 为避免细胞边缘聚集的蛋白被误判为膜定位，可通过细胞收缩后观察荧光是否随细胞膜移动来区分，也可与膜定位marker共定位。‌同时也要连续扫描同一细胞区域（间隔5-10分钟），确认信号无弥散或偏移，从而对定位稳定性进行验证。‌

Q：为什么要提供GFP空载的对照图片？

A: 作为整个实验过程中的操作参照，可排除因实验操作而导致目的基因没有荧光信号的影响。作为载体体系的参照，确认构建载体时所使用的载体是可正常表达荧光蛋白的。

Q：GFP是细胞全局定位，如果连入基因后跟GFP定位一样，是否这种定位无意义？

A: 这种定位只能说和GFP一样，但为了说明蛋白某种功能，必须在需要行使功能的细胞器里有定位；如果全局都有，证明起码这个蛋白是能行使功能的，GFP一般不影响蛋白的亚细胞定位。

Q：拍摄时为什么有明场通道？

A: 显示细胞状态，有活力的细胞应该有正确且明显的细胞形态，变形或破碎的细胞说明此时细胞不是最适状态或细胞已死亡。显示荧光确实是细胞内蛋白表达的，而不是细胞碎片及杂质产生的杂光。

Q：转化效率低，如何提高？

A: 提高转化效率的方法包括优化基因枪或农杆菌介导的转化条件，如菌液浓度和共培养时间。另外，使用合适的启动子和增强子也可以增强基因的表达。

Q：如何解释蛋白质在多个亚细胞结构中定位？

A: 蛋白质可能在不同条件下或发育阶段中具有不同的功能，因此可能存在于多个亚细胞结构中。这可能需要通过进一步的实验，如条件变化下的重复实验或使用特定抑制剂，来验证蛋白质的动态定位。

Q：荧光信号不稳定，如何改善？

A: 确保培养条件稳定，避免光照和温度的剧烈变化，使用新鲜配制的培养基，以及优化GFP表达的启动子，可以提高荧光信号的稳定性。

Q：荧光信号弱，如何解决？

A: 侵染效率低或表达时间不足。需要优化侵染染条件（如增加质粒量、提高菌液浓度等）、延长表达至48-72小时等。

Q：如何避免荧光淬灭？

A: 使用抗光漂白的荧光蛋白变体，如EGFP，以及在实验过程中尽量减少光照时间，使用低功率光源，可以减少荧光淬灭。

Q：对基因做定位预测后，是否可以直接做共定位？

A: 不同的预测网站有不同的计算方法，同一个基因在不同的预测网站也可能得出不同的定位结果。另外所有的结果都应是基于实验得到的，对于不清楚可能定位在哪里的基因，一般推荐先做普通定位，根据普通定位的结果再决定做哪种细胞器的共定位。

Q：共定位系数假阳性什么原因？

A: 通道串色或过曝。严格设置单标对照，降低激光功率或增益。

Q：细胞死亡或形态异常是什么原因？

A: 侵染操作不当或荧光蛋白过表达。应减少质粒用量，降低农杆菌浓度，严格按照侵染步骤操作。

表格下载

亚细胞定位服务登记表