常见问题
答：当目标蛋白为分泌肽或含信号肽结构，预测定位于细胞外基质时，可先做初步定位，观察其是否存在胞质弥散或细胞边缘聚集的定位情况，也可对分泌蛋白进行监测，分别在侵染后24h、48h、72h取样，观察荧光从内质网→高尔基体→囊泡的动态迁移。如有，可追加质壁分离验证；对于明确为胞内细胞器定位的蛋白则无需质壁分离。
质壁分离的最佳处理时间是在荧光蛋白充分表达后（农杆菌注射后48-72小时）进行，过早处理易因蛋白表达不足导致信号微弱。
【操作流程】：① 叶片处理：切取表达荧光融合蛋白的烟草叶片（约1cm²）。② 浸入 0.5–0.8 M蔗糖溶液（高渗液）中，避光孵育10-15分钟。③ 显微观察：将叶片置于载玻片上，加盖玻片轻压，激光共聚焦显微镜下观察。原生质体与细胞壁分离形成空隙表明质壁分离成功。④ 定位判定荧光信号位于空隙处（质外体），或附着于收缩的原生质体（膜结合）。
【注意事项】：① 质壁分离会破坏细胞膜完整性并改变蛋白分布环境，而分泌蛋白的定位需在活细胞或接近生理状态下观察，以保持其动态分泌过程的真实性。实验处理不当会导致细胞破裂或死亡，荧光信号弥散。因此蔗糖浓度需要优化，蔗糖处理时间严格控制在10-15分钟。② 渗透胁迫可诱导蛋白错误定位（如应激蛋白向膜迁移），应该进行关键对照实验设计，观察排除。③ 为避免细胞边缘聚集的蛋白被误判为膜定位，可通过细胞收缩后观察荧光是否随细胞膜移动来区分，也可与膜定位marker共定位。同时也要连续扫描同一细胞区域（间隔5-10分钟），确认信号无弥散或偏移，从而对定位稳定性进行验证。
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